Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos

Título:

CRISPR/Cas9: el virus de la hepatitis B como blanco

Tipo de edición:

• Ex vivo: La edición genética se realizó en células HepG2/NTCP infectadas en cultivo, no directamente en el organismo.
• Somática: El enfoque se dirige a hepatocitos infectados, no se trata de una línea germinal ni afecta a células reproductivas.

Dirigido hacia: cccDNA del virus de la hepatitis B (HBV), que es la forma persistente del genoma viral en el núcleo del hepatocito infectado.

Dirigido por: CRISPR/Cas9, guiado por diferentes sgRNAs (ARNs guía) específicos contra regiones críticas del HBV (como ENII/CP/X y Pre-C).

Vectores: Vector lentiviral, y se usaron dos construcciones principales:

• NT-GFP (Lentivirus NTCP-GFP): Introduce el receptor NTCP (sodium taurocholate co-transporting polypeptide) en las células HepG2, haciéndolas permisivas a la infección por HBV.
• pCW-Cas9 (Lentivirus Cas9 inducible): Expresa la endonucleasa Cas9, bajo el control de un promotor inducible por doxiciclina.

Órgano para tratar: Hígado, ya que el HBV infecta preferentemente hepatocitos.

Vía de administración: En el estudio experimental se aplicó Transducción viral ex vivo usando lentivirus para introducir:

• El receptor NTCP (permitiendo la infección por HBV).
• El sistema Cas9 y los sgRNAs específicos.

Aunque no se aplica directamente en humanos, una posible vía clínica futura sería la administración sistémica o dirigida al hígado mediante vectores virales o nanopartículas.

Resultados a corto plazo: Reducción de células positivas para el antígeno HBcAg entre 6 y 10 veces, lo que indica inhibición significativa de la replicación viral.

Resultados a mediano plazo:

• Los mutantes generados muestran inactivación funcional del cccDNA, aunque siguen siendo estables durante días.
• No se observa mayor efecto antiviral cuando se combina con interferón-α, aunque este mostró toxicidad en dosis altas.

Resultados a largo plazo: Aún no hay resultados clínicos a largo plazo, pero se sugiere que esta técnica podría llevar, en el futuro, a la eliminación funcional del cccDNA viral si se logra optimizar la entrega y estabilidad del sistema en hepatocitos humanos in vivo.

Figura 1. Ciclo de vida y organización genómica del VHB.

Referencia Bibliográfica:

1. Seeger C, Sohn JA. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol Ther Nucleic Acids. 2014. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2162253116303559

Ejemplo de Terapia Regenerativa o Terapia Celular o Terapia con Stem Cells

Terapia intratecal con células madre neurales en la esclerosis múltiple (EM) progresiva

Tema: Eficacia de la terapia intratecal con células madre mesenquimales y progenitoras neurales en la EM progresiva: resultados de un ensayo clínico de fase II, aleatorizado y controlado con placebo

Tipo de Célula Madre: MSC‑NP autólogas, células progenitoras neurales derivadas de células madre mesenquimales del propio paciente (médula ósea)

Método de Obtención

• Se aislaron MSC de la médula ósea mediante aspirado.
• Las células se expandieron ex vivo, luego se diferenciaron en medio neural durante ~14 días hasta convertirse en MSC‑NP, todos bajo condiciones cGMP.
• Se congelaron y revitalizaron antes de cada tratamiento, asegurando viabilidad ≥ 80 % y una dosis de hasta 10 millones de células por inyección.

Vía de Administración: Intratecal (inyección lumbar), hasta 6 dosis de MSC‑NP administradas cada 2 meses durante el primer año.

Resultados

A corto plazo (hasta 12 meses)

• Mayor velocidad al caminar (pruebas T25FW y 6MWT).
• Mejor función urinaria: el 76 % de los tratados mejoró frente al 27 % del grupo placebo.
• Se observó preservación del volumen de materia gris en pacientes con signos iniciales de atrofia cerebral.
• No hubo efectos secundarios graves relacionados con la terapia.

Mediano plazo (12 a 24 meses)

• La terapia siguió siendo segura: los efectos adversos más frecuentes fueron dolores de cabeza tras la punción lumbar.
• No aparecieron nuevas lesiones cerebrales en las resonancias (MRI).
• No hubo cambios notables en el volumen cerebral general.
• En los pacientes que mejoraron clínicamente se observó: Aumento de MMP‑9 y disminución de CCL2 (un marcador inflamatorio).

Largo plazo (hasta 30–36 meses)

• En el seguimiento prolongado, no se reportaron efectos adversos graves hasta los 30 meses.
• Los pacientes no mostraron deterioro clínico ni progresión en imágenes cerebrales.
• Se mantuvo la estabilidad clínica y funcional a largo plazo en los pacientes tratados.

 

Figura 1. El tratamiento con MSC-NP se asoció con una mejor función vesical y una reducción de la PVR.

Referencia Bibliográfica:

1. Harris VK, Shih M-C, Iyer A, Hinson SR, Jaiswal S, Johnson K, et al. Efficacy of intrathecal mesenchymal stem cell-neural progenitors in progressive multiple sclerosis: a randomized double-blind placebo-controlled phase II study. Stem Cell Res Ther. 2024 May 20;15(1):130. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38783390/

Anexos:

Forma de búsqueda

Ejemplos de ADN recombinante

ADN recombinante en la naturaleza

En Campylobacter jejuni y Campylobacter coli, bacterias patógenas comunes en aves y cerdos, se ha demostrado la generación de ADN recombinante de forma completamente natural, sin intervención humana. Mediante transformación natural, estas bacterias pueden captar fragmentos de ADN libre en su entorno e integrarlos en su propio cromosoma gracias a recombinación homóloga, que reemplaza o inserta secuencias similares. (1)

Como consecuencia las cepas receptoras adquirieron genes funcionales de resistencia, como tet(O) para tetraciclina y blaOXA para betalactámicos, creando nuevas variantes resistentes.

Imagen obtenida de

ADN recombinante artificial

Tema: Desarrollo de un plásmido bicistrónico no viral para la terapia génica de isquemia de miembro inferior, que exprese simultáneamente HGF y VEGF165 para inducir angiogénesis terapéutica.(2)

Objetivo: Crear y evaluar plásmidos para coexpresar HGF y VEGF165 y restaurar la perfusión en tejido isquémico.

Gen o secuencia para clonar

• HGF (Hepatocyte Growth Factor) humano, codón-optimizado.
• VEGF165 (isoforma del Vascular Endothelial Growth Factor-A) humano, codón-optimizado.

Enzimas de restricción: En las prácticas estándar con pVAX para genes terapéuticos, se usan enzimas de restricción estándar como HindIII, EcoRI, XhoI.

Enzima ligasa: No se especifica, pero usualmente se emplea T4 ligasa para construir estos vectores recombinantes.

Vector: pVAX-based plasmid (vector de vacuna de primera generación). Construcción bicistrónica con dos promotores independientes (CMV para HGF y CAG para VEGF165).

Célula receptora:

• Células musculares esqueléticas de ratón (en modelo in vivo).
• HEK293T (células humanas modificadas, derivadas de riñón embrionario) en estudios de validación in vitro.

Mecanismo de transferencia o inserción del gen:

• Inyección intramuscular directa del ADN plasmídico desnudo.
• En algunos experimentos, electroporación de bajo voltaje para aumentar la transfección en músculo ex vivo.

Métodos de identificación de clones:

• ELISA para cuantificar HGF y VEGF165 en medio de cultivo de HEK293T y explantes musculares.
• HUVEC, verifica si las proteínas inducen formación de vasos en células endoteliales.
• Medición de perfusión con Doppler láser en modelo murino.

Imagen obtenida de

Referencias Bibliográficas:

1. Guernier V, Trachsel J, Maki J, Qi J, Sylte MJ, Hanafy Z, et al. Natural Horizontal Gene Transfer of Antimicrobial Resistance Genes in Campylobacter spp. From Turkeys and Swine. Front Microbiol. 2021;12:732969. Disponible en: https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.732969
2. Vinokurov M, Yakovlev A, Ushnitsky I, Palshin G, Petrov A, Popov V, et al. The Experience of Using “Neovasculgen” in the Complex Treatment of Patients with Critical Lower Limb Ischemia. Int J Biomed. 2020;10(3):287–90. Disponible en: https://www.ijbm.org/articles/i39/ijbm_10(3)_shc1.pdf

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